普通RT-PCR检测 PCR技术(Polymerase Chain Reaction，PCR)是在体外将特定DNA片段扩增几百万倍的生物学技术，是目前敏感性最高、特异性最强、实验室最常用的一种病原检测方法。随着PCR技术不断的发展，先后出现了套式PCR、多重PCR以及实时荧光定量RT-PCR技术，该技术广泛应用于临床检测并不断促进自身发展，国内外许多学者都对其有深入研究。 实时荧光定量PCR技术是将常规PCR与荧光化学物质相结合的检测技术。可高灵敏、高特异的对核酸进行定量分析。根据荧光化学物质与DNA结合的特异性可将其分为SYBR Green I染料法和TaqMan水解探针法。SYBR Green I染料游离情况下仅可发出微弱光芒，但在DNA扩增时，SYBR Green I非特异性的与双链DNA的小沟结合，从而发出强烈荧光：特异性结果可通过溶解曲线分析。 对于一个新的靶分子建立实时PCR定量分析的过程包括：①设计步骤一PCR引物和探针的选择；②根据特定分析的要求，选择实时PCR的检測方法。使用SYBRGreen的实时PCR通常被用于优化引物，且被主要用于在研究中检测PCR产物TaqMari探针和分子信号提供了更好的特异性。 查看详情

相对定量基因/基因绝对定量Real time-PCR检测 PCR技术(Polymerase Chain Reaction，PCR)是在体外将特定DNA片段扩增几百万倍的生物学技术，是目前敏感性最高、特异性最强、实验室最常用的一种病原检测方法。随着PCR技术不断的发展，先后出现了套式PCR、多重PCR以及实时荧光定量RT-PCR技术，该技术广泛应用于临床检测并不断促进自身发展，国内外许多学者都对其有深入研究。 实时荧光定量PCR技术是将常规PCR与荧光化学物质相结合的检测技术。可高灵敏、高特异的对核酸进行定量分析。根据荧光化学物质与DNA结合的特异性可将其分为SYBR Green I染料法和TaqMan水解探针法。 TaqMan水解探针法可特异性的与目的基因结合，其原理：TaqMan在完整状态下其5’端荧光集团所发射的荧光信号被3’端猝灭集团吸收，PCR扩增时，探针与引物所包含的目的基因序列进行杂交，当Taq外切酶移动到杂交处时，便发挥其5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，荧光集团与猝灭集团分离，猝灭集团不能吸收荧光，所发射荧光可被荧光系统检测。因为每形成一个DNA双链就有一个荧光信号产生，所以荧光信号就代表了扩增产物的有效特异信号。 查看详情

RNA提取 总RNA提取试剂盒，可以用来制备高质量的可用于建库的RNA。总RNA 纯化系统采用两种著名的RNA 酶抑制剂，异硫氰酸弧(GTC)和β-巯基乙醇，加上整个操作都在冰浴下进行，这样就能显著降低RNA的降解速率。GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用，将促使核蛋白复合体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA 释放到溶液中。而进一步从复合体中纯化RNA，则根据Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法进行，采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚将使RNA进入水相，这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。水相中的RNA可用异丙醇沉淀浓缩。进一步将上述RNA沉淀复溶于GTC溶液中，接着用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐，而RNA中如含无机盐，则有可能对以后操作中的一些酶促反应产生抑制。 查看详情

gDNA提取 在浓氯化钠（1-2 mol/L）溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很大，核糖核蛋白的溶解度很小，在稀氯化钠（0.14 mol/L）溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很小，核糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。 查看详情

SNP直接测序法 由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态性(Polymorphism)。据估计，在人类基因组中，大约每千个碱基中有一个SNP，无论是比较于限制性片段长度多态性(RFLP)分析还是微卫星标记(STR)，都要广泛得多。SNP是我们考察遗传变异的最小单位,据估计，人类的所有群体中大约存在一千万个SNP位点。一般认为，相邻的SNPs倾向于一起遗传给后代。于是，我们把位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点称作单体型（haplotype）。大多数染色体区域只有少数几个常见的单体型（每个具有至少5%的频率），它们代表了一个群体中人与人之间的大部分多态性。一个染色体区域可以有很多SNP位点，但是我们一旦掌握了这个区域的单体型，就可以只使用少数几个标签SNPs(tagSNP)来进行基因分型，获取大部分的遗传多态模式。 查看详情

TA克隆 TA克隆方法（Original TA Cloning Kit）把baiPCR片断与一个具有3‘du-T突出的载体DNA连接起来的方zhi法。因为PCR反应中所使用的dao聚合酶具有末端转移的活性，通常在3'加上A。 PCR产物克隆大致分为两类，即平头连接和粘头连接。平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR 产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平头；PCR 产物纯化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。如果要求不高，PCR 产物也可不加处理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶，这两种酶有5’→3’校对能力，扩增出来的PCR 产物已经是平头，可以不作平端处理。平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下，即使使用很高单位的连接酶，或在反应体系中加入PEG 8000，也只能很有限地提高效率。 粘头连接也可以大致分为两类，一类粘头连接是用某种方法，在载体和PCR 产物上产生长的可互补的粘性末端。最普遍的方法是在引物的5’端加入一段某种限制酶的识别序列。如果两个引物选用不同的限制性内切酶识别序列，就可以做到定向连接。另一类利用部分PCR 产物3’端带有一个凸出的dAMP的特性，构建3’端带有凸出的dTMP的载体。一般采用的方法是先把载体用某种限制性内切酶消化成平头，在70℃或72℃下在只加入一种dNTP、即dTTP的反应体系中用Taq DNA聚合酶处理半小时（也有人报道处理1～2小时能提高克隆 效率，这样加T反应会更彻底）。也可以用末端转移酶来完成加T反应。载体自连、PCR 产物串连可以忽略。如果使用ddTTP，效果会更好。这种方法一般称为加T/A法克隆，比平头连接效率高50～100倍。 查看详情

cDNA克隆/文库 cDNA文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典cDNA文库构建的基本原理是用Oligo(dT)作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。 其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA文库的关键步骤之一。（2）cDNA第一条链的合成。（3）cDNA第二条链的合成。（4）双链cDNA的修饰。（5）双链cDNA的分子克隆。（6）cDNA文库的扩增。（7）cDNA文库鉴定评价。 查看详情

定点突变 定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。 查看详情

SiRNA化学合成 多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的pol III 启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几周甚至数月的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。 查看详情